¡derechos reservados quitó: --> El Depyrogenation refiere al retiro de pirógenos de la solución, lo más comúnmente posible de los productos farmacéuticos inyectables.

Un pirógeno se define como cualquier sustancia que pueda causar una fiebre. Un pirógeno puede ser una endotoxina o una exotoxina, aunque la mayoría de los pirógenos sean endógenos. Las endotoxinas son moléculas de Lipopolysaccharide (LPS) encontradas como parte de la pared celular de las bacterias gramnegativas (véase a la derecha), y se lanzan sobre todo sobre lisis de la célula. Las endotoxinas son típicamente solamente tóxicas cuando están encontradas en la circulación sanguínea, y las bacterias gramnegativas existen rutinario en intestinos humanos, pero no causan un efecto pirogénico.

La fiebre que induce el aspecto de pirógenos no refiere a fiebre como parte de una inmunorespuesta normal, como puede ser el caso con la gripe, por ejemplo. Algo, la fiebre se causa como un resultado directo de la exposición del pirógeno y es uno de los síntomas del choque séptico . Cuando los LPS se lanzan sobre lisis de la célula, " Lípido A" ata a las proteínas LPS-obligatorias en la circulación sanguínea, que interactivo con los receptores CD14 en las células endoteliales (especialmente macrófagos y los monocitos ) y los hace secretar los niveles crecientes de cytokines favorable-inflamatorios y de óxido nítrico, que lleva al choque séptico.

Niveles aceptables máximos de la endotoxina

Porque el peso molecular de la endotoxina puede variar mucho (10.000 DA), los niveles de la endotoxina se miden en " units" de la endotoxina; (UE). Una UE es aproximadamente equivalente a la página 100 del lipopolysaccharide de Escherichia Coli -- las actuales adentro alrededor 105 bacterias de la cantidad. Los seres humanos pueden desarrollar síntomas cuando están expuestos a tan poco como peso corporal de 5 EU/kg. Estos síntomas incluyen, pero no se limitan a, fiebre, tensión arterial baja, ritmo cardíaco creciente, y salida baja de la orina; e incluso las pequeñas dosis de la endotoxina en la corriente de la sangre son a menudo fatales.

El FDA ha fijado los niveles permitidos máximos siguientes de la endotoxina para las drogas distribuidas en los Estados Unidos:
Droga (inyectable, intratecal) - 0.2 productos de EU/kg
Droga (inyectable, no-intratecal) - producto de 5 EU/kg
Agua estéril - 0.5 EU/ml (depende de uso previsto)

Detección del pirógeno

Prueba del conejo del

La detección temprana de la endotoxina fue lograda inyectando conejos con la muestra y observando la respuesta en su temperatura del cuerpo. Los conejos tienen tolerancia similar de la endotoxina a los seres humanos, y eran así una opción ideal. Sin embargo, este método era protestas costosas, desperdiciadoras de tiempo, e incitadas de abogados de las derechas de animales. Pero quizás la desventaja más grande de esta prueba era su inhabilidad de cuantificar el nivel de la endotoxina.

Prueba LAL

Actual, el método de opción para la detección de la endotoxina es la prueba de Amebocyte Lysate (LAL) del Limulus. Esta prueba se basa en la observación del Dr. Federico Bang's que la sangre del cangrejo de herradura forma coágulos cuando está expuesta a las endotoxinas. El extracto del amebocito de la sangre del cangrejo de herradura se mezcla con una muestra sospechosa de la contaminación de la endotoxina, y se observa una reacción si las endotoxinas están presentes. El FDA ha aprobado cuatro variaciones de la prueba de LAL: análisis del gel-coágulo, turbidimétrico, colorimétrico, y cromogénico. Las diferencias en estas variaciones refieren a las características de la reacción del amebocito/del endtoxin (e. el gel-coágulo produce un precipitado y un color colorimétrico de los cambios). Esta prueba está rápidamente (aproximadamente 30 minutos) y alto - sensible (hasta 0.005 sensibilidades de EU/ml). Sin embargo, porque detecta solamente las endotoxinas de los LPS, algunos materiales pirogénicos pueden ser faltados. También, ciertas condiciones (las condiciones subóptimas del pH o concentración inadecuada del catión ) pueden llevar a las negativas falsas. Los glucanos de matrices de la cromatografía del carbohidrato pueden también llevar a los positivos falsos.

Retiro del pirógeno (Depyrogenation)

Los pirógenos pueden a menudo ser difíciles de quitar de la solución debido a la alta variabilidad de su peso molecular. Los pirógenos son también relativamente termal estables e insensibles a los cambios de pH. Sin embargo, varias técnicas del retiro existen.

cromatografía de intercambio iónico del

Las endotoxinas están negativamente - cargado, y atarán a un cambiador de anión . Si la sustancia de la blanco no está también negativamente - cargado, pasará a través de la columna antes de la endotoxina, y una separación eficaz puede ser alcanzada. Este método se utiliza a veces en la purificación de las albúminas (los detalles siguen). Los Ligands de la afinidad sabida a las endotoxinas se pueden juntar a un sistema del intercambio de aniones para aumentar su fuerza obligatoria de la endotoxina y para mejorar más lejos la pureza del producto final. Los ejemplos típicos de los ligands obligatorios de la endotoxina incluyen la histamina, compuestos heterocíclicos con nitrógeno, y la polimixina B . Sin embargo, la polimixina B se sabe para inducir la producción de interleukin-1, un pirógeno exógeno, y se debe demostrar así para ser ausente en el producto final si está utilizada.

Ejemplo de la cromatografía del intercambio de aniones que usa para purificar la albúmina (Uppsala):
el 2% del de la endotoxina no hace lazo de a la columna. Sin embargo, este 2% elimina antes del pico de la albúmina, y puede ser quitado así simplemente comenzando la colección después de que este 2% haya eliminado.
el 10% de la endotoxina que el hace lazo de a la columna (9.8% del total original) eliminarán eventual después del pico de la albúmina. Esto se puede prevenir de entrar en el producto final parando la colección antes de que suceda éste.
El 90% restante de la endotoxina encuadernada (88.2% del total original) se deben limpiar la columna usar el NaOH

Una alternativa al intercambio de aniones es la cromatografía del intercambio catiónico, en la cual positivamente - los solutos cargados atan a los medios cromatográficos sólidos. En este método, la blanco ata a la columna en vez de la endotoxina. La endotoxina entonces se lava a través de la columna, y una blanco pura se enjuaga más adelante de la columna. La cromatografía del intercambio catiónico se ha demostrado para purificar con eficacia la purificación del β-interferón. (Dembinski, y otros)

ultrafiltración del

Porque el peso molecular de endoxins está generalmente sobre el kD 10, la ultrafiltración se puede utilizar a veces para realizarse como separación basada tamaño. Debido a la alta variabilidad del tamaño de la endotoxina, puede ser difícil seleccionar la membrana correcta, por lo tanto este método es mejor usado solamente cuando todas las endotoxinas presentes son más grandes de 300.

destilación del

Este método también se basa en el peso molecular y la estabilidad al calor grandes de endotoxinas. Los solventes de poco peso molecular pueden ser purificados fácilmente hirviendo y recogiendo el vapor condensado en un recipiente de la endotoxina libremente (véase el " heating" debajo). Las moléculas grandes de los LPS no se vaporizan fácilmente, y se van así detrás en el recipiente de la calefacción. Éste es el método de opción para la purificación del agua.

Inactivación/destrucción

Porque los pirógenos son a menudo difíciles de quitar, la inactivación o la destrucción de la molécula de los LPS puede a veces ser preferible.

hidrólisis de la Ácido-base del ¡ Este método se ha demostrado para hender el lípido A del polisacárido en la molécula de los LPS (véase a la derecha). La mitad del lípido solamente no es soluble en agua. Así incapaz de atar a las células endoteliales, se hace inactiva. Sin embargo, la hidrólisis de la ácido-base puede desnaturalizar una proteína de la blanco, y es así inadecuada al purificar una proteína.

oxidación del

La oxidación usar el peróxido de hidrógeno es de uso frecuente como solución de destrucción del pirógeno del bajo costo. El mecanismo para esta destrucción es desconocido, pero el peróxido de hidrógeno se puede quitar fácilmente más lejos rio abajo en el proceso de la purificación, y es por lo tanto un método útil de retiro del pirógeno. Sin embargo, como la hidrólisis de la ácido-base, no es conveniente al purificar las proteínas.

Calefacción

Los métodos de calefacción tales como que esteriliza son de uso frecuente asegurarse de que el vidrio y el otro equipo de laboratorio están libres del material pirogénico. Aunque las endotoxinas sean relativamente termal establo, la suficiente calefacción (250°C para el minuto 30) da lugar a una reducción 3log de los niveles de la endotoxina. Debido a los niveles des alta temperatura, este método no es también conveniente al purificar las proteínas.

Hidróxido de sodio del

Al purificar las proteínas, el hidróxido de sodio (NaOH) se puede utilizar con seguridad y eficazmente. Es también ampliamente utilizado para el depyrogenation del equipo no-apto para el autoclave (e. plásticos) y de las columnas de cromatografía. De hecho, al usar a un cambiador de anión para quitar los pirógenos, es necesario limpiar la columna con el NaOH después de cada hornada.

Métodos preventivos

Porque virtualmente todas las materias primas implicadas en un proceso de producción, incluyendo empleados de la fábrica, pueden ser fuentes potenciales de contaminación del pirógeno, la investigación y el depyrogenation de la materia prima pueden ir a menudo una manera larga a asegurar el producto final está libres de pirógenos y no requiere métodos costosos del retiro o de la inactivación. La ultrafiltración de productos químicos y de soluciones tampón, la aplicación de prácticas higiénicas apropiadas, y la ejecución de pruebas regulares pueden toda ser provechosas.

Ver también

Endotoxina
rio abajo que procesa

.

Zenithic

Depyrogenation

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