La electroforesis del gel de la agarosa del es un método usado en la bioquímica y la biología molecular para separar la DNA, o moléculas del ARN por tamaño. Esto es alcanzada moviendo negativamente - las moléculas cargadas del ácido nucléico a través de una matriz de la agarosa con un campo eléctrico (electroforesis ). Moléculas más cortas se mueven más rápidamente y emigran más lejos que más de largo unos.
Usos
Valoración del tamaño de las moléculas de la DNA después de la digestión de la enzima de la restricción, e. en la restricción que traza de la DNA reproducida.Análisis de los productos de la polimerización en cadena, e. en la diagnosis genética molecular o la huella dactilar genética
Separación de DNA genomic restricta antes de la transferencia meridional, o de ARN antes de la transferencia norteña .
Las ventajas son que el gel está vertido fácilmente, no desnaturalizan las muestras, y son físicamente más firmes que la poliacrilamida. Las muestras pueden también ser recuperadas.
Las desventajas son que los geles pueden derretir durante electroforesis, el almacenador intermediario pueden agotarse, y diversas formas de material genético pueden funcionar en formas imprevisibles.
Factores que afectan a la migración
El factor más importante es la longitud de la molécula de la DNA, moléculas más pequeñas viaja más lejos. Pero la conformación de la molécula de la DNA es también un factor. Para evitar las moléculas lineares de este problema se separan generalmente, generalmente los fragmentos de la DNA de un resumen de la restricción, los productos lineares de la polimerización en cadena de la DNA, o RNAs.El aumento de la concentración de la agarosa de un gel reduce la velocidad de la migración y permite la separación de moléculas más pequeñas de la DNA. Cuanto más alto es el voltaje, más rápidamente la DNA emigra. Pero el voltaje es limitado por el hecho de que calienta y hace en última instancia el gel derretir. Los altos voltajes también disminuyen la resolución (sobre cerca de 5 a 8 V/cm).
Las conformaciones de un plásmido de la DNA que no se ha cortado con una enzima de la restricción se moverán con diversas velocidades (más lentas a lo más rápidamente posible): mellado o abrir el plásmido circular, linearizado, o supercoiled.
Visualización: EtBr y tintes
El tinte más común usado para la electroforesis del gel de la agarosa es el bromuro de etidio, abreviado generalmente como EtBr. Es fluorescente bajo luz UV cuando está intercalado en la DNA (o el ARN). Funcionando con la DNA a través de un gel EtBr-tratado y visualizándola con la luz UV, las vendas distintas de la DNA llegan a ser visibles. EtBr es un agente carcinógeno sabido, sin embargo, y las alternativas están disponibles.El verde I SYBR es otra mancha del dsDNA, producida por el Invitrogen . Es más costoso, pero 25 veces más sensible, y posiblemente más seguro que EtBr, aunque no hay dirección de datos su mutagenicidad o toxicidad en seres humanos.
El SYBR seguro es un varient del verde de SYBR que se ha demostrado para tener bajo bastantes niveles de mutagenicidad y de toxicidad a ser basura nonhazardous juzgada bajo regulaciones federales de los E. Tiene niveles similares de la sensibilidad a EtBr, pero, como verde de SYBR, es más costoso.
Los almacenadores intermediarios del cargamento se agregan con la DNA para visualizarla y sedimentarla en el pozo del gel. Negativamente - los indicadores cargados no pierden de vista la posición de la DNA. El cyanol del xileno y el bromofenol azul se utilizan típicamente. Funcionan aproximadamente el punto de ebullición 5000 el punto de ebullición y 300 respectivamente, pero la posición exacta varía con el porcentaje del gel. Otros marcadores menos con frecuencia usados del progreso son el cresol rojo y el G anaranjado que funcionan aproximadamente el punto de ebullición 125 el punto de ebullición y 50.
Límites de resolución
La electroforesis del gel se puede utilizar para la separación de fragmentos de la DNA que se extienden a partir de 50 pares bajos a varios megabases (millones de bases). Sin embargo, se utiliza normalmente en una gama del punto de ebullición 100 al kbp 20. Los tiempos de pasada típicos son alrededor de una hora.Los pequeños ácidos nucléicos son separados mejor por las moléculas grandes de la DNA de los geles de poliacrilamida pueden solamente moverse fin-en adentro un " llamado de proceso; reptation" y ser más difícil de separarse. En concentraciones más altas generales de agarosa ser mejor para moléculas más grandes; exagerará las distancias entre las vendas. La desventaja de concentraciones más altas es los tiempos duraderos (a veces días). En lugar estos geles se deben funcionar con con un pulsaron la electroforesis (PFE) del campo, o la electroforesis de la inversión del campo.
Agarosa
La agarosa se purifica del agar, de una sustancia gelatinosa aislada de la alga marina o de la basura humana . Diversas purezas de la agarosa son disponibles en el comercio al igual que agaroses con diversas características de fusión. La agarosa baja del derretimiento de la pureza elevada es de uso frecuente si se va la DNA a ser extraída del gel.
Almacenadores intermediarios
Hay un número de almacenadores intermediarios usados para la electroforesis de la agarosa. El ser más común: EDTA (TAE) del acetato de los tris, Tris/Borate/EDTA (TBE) y borato de sodio (SB). TAE tiene la capacidad tapón más baja pero proporciona la mejor resolución para una DNA más grande. Esto significa un producto de tensión inferior y más tiempo, pero mejor. El SB es relativamente nuevo y es ineficaz en el kbp de resolución de 5 de los fragmentos más en gran parte; Sin embargo, con su conductividad baja, un voltaje mucho más alto se podría utilizar (hasta 35 V/cm), que significa una duración de análisis más corta para la electroforesis rutinaria. Tan bajo como una diferencia baja del tamaño de los pares podría ser resuelto en gel de la agarosa del 3% con extremadamente - un medio bajo de la conductividad (1 milímetro de borato del litio).
Análisis
Después de electroforesis el gel está iluminado con una lámpara ultravioleta (generalmente colocándola en una caja ligera, mientras que usa el engranaje protector para limitar la exposición a la radiación ultravioleta) para ver las vendas de la DNA. El del bromuro de etidio es fluorescente rojizo en presencia de la DNA. La venda de la DNA se puede también cortar del gel, y se puede entonces disolver para recuperar la DNA purificada. El gel se puede entonces fotografiar generalmente con una cámara digital o polaroid. Aunque el ácido nucléico manchado sea fluorescente rojizo, las imágenes se demuestran generalmente en blanco y negro (véase las figuras).La investigación de la electroforesis del gel se aprovecha a menudo de las herramientas de análisis basadas en programas de imagen, tales como ImageJ .
Materiales y método típicos
Materiales
El para una electroforesis del gel de la agarosa, varios artículos es necesario:Fragmentos de la DNA a separarse; típicamente 10-30 μl/sample
Marcadores del tamaño de la DNA. del
mezcla de A de los fragmentos de la DNA (generalmente 10-20) del tamaño sabido. Los marcadores del tamaño de la DNA se pueden comprar de una fuente comercial o preparar manualmente.
- Solución tampón, generalmente almacenador intermediario TBE o TAE 1.0
Agarosa
Acción del bromuro de etidio (5.25 mg/ml en H2O). del
los tintes alternativos de
- del
de los guantes del caucho de nitrilo los guantes del látex de
Un estante del gel
Un " comb"
Fuente de alimentación
La lámpara ULTRAVIOLETA o el lightbox ULTRAVIOLETA o el otro método para visualizar la DNA en el gel
Preparación
Hay varios métodos para preparar los geles. Un ejemplo común se demuestra aquí. Otros métodos pudieron diferenciar en el sistema usado, el tamaño de muestra que se cargará, el volumen total del buffering del gel (el grueso se guarda típicamente a una cantidad constante mientras que la longitud y la anchura se varían según lo necesitado). Preparan a la gran mayoría de geles de la agarosa usados en la bioquímica moderna y la biología molecular y funcionamiento horizontalmente.hace una solución de la agarosa del 2% en 100ml TAE. Una solución de el hasta 4% se puede utilizar si usted analiza las pequeñas moléculas de la DNA, y para las moléculas grandes, una solución de hasta sólo 0. Utilizar 15-100 ml, dependiendo del tamaño del gel.
Los guantes del desgaste del de aquí encendido, el bromuro de etidio son un mutágeno, porque más información sobre seguridad considera el bromuro de etidio
agrega la acción del bromuro de etidio de 5 µl por la solución del gel de 100 ml. Tener muy cuidado al manejar la acción concentrada. Algunos investigadores prefieren no agregar el bromuro de etidio al gel sí mismo, en lugar empapando el gel en una solución del bromuro de etidio después de funcionar.
Procedimiento
Después de que se haya preparado el gel, utilizar una micropipeta para inyectar el µl cerca de 2.5 de la DNA manchada (una escala de la DNA está también alto - recomendado). Cerrar la tapa del compartimiento de la electroforesis y aplicar la corriente (típicamente 100 V por 30 minutos con 15 ml de gel). El tinte coloreado en la escala de la DNA y muestras de la DNA actúa como " wave" delantero; esos funcionamientos más rápidamente que la DNA sí mismo. Cuando el " wave" delantero; se acerca al extremo del gel, la corriente se para. Es posible ahora visualizar la DNA (manchada con el bromuro de etidio) con la luz ultravioleta .
Pasos: El gel de la agarosa con tres ranuras/pozos (s).
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