Microscopia MI del ·CRO (coordinadora)·co·PY (la pronunciación mahy-kruh-skoh-hace pis). Es de uso frecuente más específicamente como técnica de usar un microscopio. La microscopia se ha desarrollado con el desarrollo de microscopios. Por lo tanto hay tres ramas principales de microscopia; el óptico, el electrón y la exploración sondan la microscopia .
La microscopia electrónica óptica e implica la difracción, la reflexión, o la refracción del incidente de la radiación sobre el tema del estudio, y la colección subsecuente de esta radiación dispersada para aumentar una imagen. Este proceso se puede realizar por la irradiación amplia del campo de la muestra (por ejemplo microscopia ligera estándar y la microscopia electrónica de transmisión ) o por la exploración de una viga fina sobre la muestra (por ejemplo microscopia confocal y microscopia electrónica de la exploración . La microscopia de la punta de prueba de la exploración implica la interacción de una punta de prueba de la exploración con la superficie o el objeto del interés. El desarrollo de la biología revolucionada microscopia y sigue siendo una herramienta esencial en esa ciencia, junto con muchos otros.
Las células vivas particularmente carecen generalmente el suficiente contraste que se estudiará con éxito, las estructuras internas de la célula son descoloridas y transparentes. La manera más común de aumentar contraste es a la mancha las diversas estructuras con los tintes selectivos, pero ésta implica el matar y el fijar de la muestra. La coloración puede también introducir los artefactos, los detalles estructurales evidentes que son causados por el proceso del espécimen y no son así una característica legítima del espécimen.
Estas limitaciones tienen, hasta cierto punto, todos superado por las técnicas específicas de la microscopia que pueden no invasor aumentar el contraste de la imagen. Estas técnicas hacen uso generalmente de diferencias en el índice de refracción de las estructuras de célula. Es comparable a la mirada a través de una ventana de cristal: usted (microscopia brillante del campo) no ve el vidrio sino simplemente la suciedad sobre el vidrio. Hay sin embargo una diferencia pues el vidrio es un material más denso, y éste crea una diferencia en la fase de la luz que pasa a través. El ojo humano no es sensible a esta diferencia en fase pero las soluciones ópticas listas se han pensado hacia fuera para cambiar esta diferencia en fase en una diferencia en la amplitud (intensidad de luz).
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brillante de la microscopia del campo La microscopia brillante del campo es la más simple de todas las técnicas de la microscopia ligera. La iluminación de la muestra está vía luz blanca transmitida, es decir iluminado de debajo y observado de arriba. Las limitaciones incluyen el contraste bajo de la mayoría de las muestras biológicas y de la resolución evidente baja debido a la falta de definición fuera del material del foco. La simplicidad de la técnica y la preparación mínima de la muestra requerida son ventajas significativas.
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la microscopia del campo oscuro La microscopia del campo oscuro es una técnica para mejorar el contraste de especímenes sin manchas, transparentes. La iluminación de Darkfield utiliza una fuente de luz cuidadosamente alineada para reducir al mínimo la cantidad de luz (O.U-dispersada) directo-transmitida que incorpora el plano de imagen, recogiendo solamente la luz dispersada por la muestra. Darkfield puede mejorar dramáticamente el contrast&mdash de la imagen; especialmente del objects&mdash transparente; mientras que requiere poco equipo fijar o muestrear la preparación. Sin embargo, la técnica sufre de intensidad de la luz corta en la imagen final de muchas muestras biológicas, y continúa siendo afectada por la resolución evidente baja.
La iluminación de Rheinberg del es una variante especial de la iluminación de campo oscuro en la cual los filtros transparentes, coloreados se insertan momentos antes del condensador para colorear rayos ligeros en la alta abertura diferentemente que ésos en la abertura baja (es decir el fondo al espécimen puede ser azul mientras que aparece el objeto amarillo luminiscente). Otras combinaciones de color son posibles pero su eficacia es absolutamente variable.
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l contraste de la fase de la microscopia del contraste de la fase del en la microscopia electrónica : el Fase-pone en contraste la proyección de imagen
Técnicas más sofisticadas demostrarán diferencias en densidad óptica en la proporción. El contraste de la fase del es una técnica ampliamente utilizada que demuestra diferencias en el índice de refracción como diferencia en cambio. Fue desarrollado por las fritas Zernike del físico del holandés en los años 30 (para cuál le concedieron a Premio Nobel En 1953). El núcleo en una célula por ejemplo aparecerá oscuro contra el citoplasma circundante. El contraste es excelente; sin embargo no está para el uso con los objetos gruesos. Con frecuencia, un halo se forma incluso alrededor de pequeños objetos, que obscurece el detalle. El sistema consiste en un anillo circular en el condensador que produce un cono de la luz. Este cono se sobrepone en un anillo clasificado similar dentro del fase-objetivo. Cada objetivo tiene un diverso anillo del tamaño, así que para cada objetivo otro ajuste del condensador tiene que ser elegido. El anillo en el objetivo tiene características ópticas especiales: en primer lugar reduce la luz directa en intensidad, pero más importantemente, crea una diferencia de fase artificial alrededor de una longitud de onda cuarta. Pues las características físicas de esta luz directa han cambiado, interferencia con la luz difractada ocurre, dando por resultado la imagen del contraste de la fase.
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diferenciado de la microscopia del contraste de interferencia
El superior y mucho más costoso es el uso del contraste de interferencia del . Las diferencias en densidad óptica aparecerán como diferencias en la relevación. Un núcleo dentro de una célula aparecerá realmente como glóbulo en el sistema diferenciado del contraste de interferencia del más de uso frecuente según el Jorte Nomarski . ¡Sin embargo, tiene que ser tenido presente que esto es un efecto óptico del, y la relevación no se asemeja necesario a la forma verdadera! El contraste es muy bueno y la abertura del condensador puede estar completamente abierta usado, de tal modo reduciendo la profundidad del campo y maximizando la resolución.
El sistema consiste en una prisma especial (prisma de Nomarski, prisma de Wollaston) en el condensador que parte la luz en un ordinario y una viga extraordinaria. La diferencia espacial entre las dos vigas es mínima (menos que la resolución máxima del objetivo). Después de paso a través del espécimen, las vigas son juntadas por una prisma similar en el objetivo.
En un espécimen homogéneo, no hay diferencia entre las dos vigas, y no se está generando ninguÌn contraste. Sin embargo, cerca de un límite refractivo (decir un núcleo dentro del citoplasma), la diferencia entre el ordinario y la viga extraordinaria generará una relevación en la imagen. El contraste diferenciado de interferencia requiere una fuente de la luz polarizada funcionar; dos filtros de polarización tienen que ser cabidos en la trayectoria ligera, una debajo del condensador (el polarizador), y la otra sobre el objetivo (el analizador).
Nota: En caso de que el diseño óptico de un microscopio produzca una separación lateral apreciable de las dos vigas que tenemos el caso de la microscopia clásica de interferencia, que no da lugar a imágenes de relevación, pero puede sin embargo ser utilizado para la determinación cuantitativa de masa-gruesos de objetos microscópicos.
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la microscopia de fluorescencia
Cuando ciertos compuestos están iluminados con la luz de la alta energía, entonces emiten la luz de una frecuencia diversa, más baja. Este efecto se conoce como fluorescencia . Los especímenes demuestran a menudo su propia imagen característica del Autofluorescence, basada en su maquillaje químico.
Este método es de importancia crítica en las ciencias de la vida modernas, como puede ser extremadamente sensible, permitiendo la detección de solas moléculas. Muchos diversos tintes fluorescentes se pueden utilizar para manchar diversas estructuras o compuestos químicos. Un particularmente método de gran alcance es la combinación de los anticuerpos juntada a un fluorocromo como en el Immunostaining . Los ejemplos de fluorocromos de uso general son la fluoresceína o la rhodamina . Los anticuerpos se pueden hacer adaptado específicamente para un compuesto químico. Por ejemplo, una estrategia a menudo funcionando es la producción artificial de proteínas, basada en el código genético (DNA). Estas proteínas se pueden entonces utilizar para inmunizar los conejos, que entonces forman los anticuerpos que atan a la proteína. Los anticuerpos entonces se juntan químicamente a un fluorocromo y después se utilizan para remontar las proteínas en las células bajo estudio.
Las proteínas fluorescentes muy eficientes tal como la proteína fluorescente (GFP) del verde se han desarrollado usar la técnica de la biología molecular de la fusión, un proceso del gene que liga la expresión del compuesto fluorescente a la de la proteína de la blanco. Esta proteína fluorescente combinada es generalmente no tóxica al organismo e interfiere raramente con la función de la proteína bajo estudio. Las células o los organismos genético modificados expresan directo las proteínas fluorescente-marcadas con etiqueta, que permite el estudio de la función original in vivo de la proteína.
Puesto que la emisión de la fluorescencia diferencia en la longitud de onda (color) de la luz de la excitación, una imagen fluorescente demuestra ideal solamente la estructura del interés que fue etiquetado con el tinte fluorescente. Esta alta especificidad llevó al uso extenso de la microscopia ligera de la fluorescencia en la investigación biomédica. Diversos tintes fluorescentes se pueden utilizar para manchar diversas estructuras biológicas, que se pueden entonces detectar simultáneamente, mientras que todavía siendo específico debido al color individual del tinte.
Para bloquear la luz de la excitación de alcanzar haber observado o el detector, los sistemas del filtro de alta calidad son necesarios. Éstos consisten en típicamente un filtro de la excitación que selecciona la gama de las longitudes de onda de la excitación un espejo dicroico, y un filtro de la emisión que bloquea la luz de la excitación. La mayoría de los microscopios de la fluorescencia se funcionan en el modo de la Epi-iluminación (iluminación y detección a partir de un lado de la muestra) para disminuir más lejos la cantidad de luz de la excitación que entra en el detector.
Ver también el microscopio de fluorescencia total de la reflexión interna .
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confocal de la microscopia de exploración del laser Genera la imagen por totalmente una manera diferente que el microscopio brillante visual normal del campo. Da una resolución levemente más alta, pero más importante proporciona el seccionamiento óptico sin la luz del hacia fuera-de-foco que disturba que degrada la imagen. Por lo tanto proporciona imágenes más agudas de los objetos 3D. Esto es de uso frecuente conjuntamente con la microscopia de fluorescencia .
Afortunadamente sin embargo, este fenómeno no es causado por procesos al azar tales como dispersión luminosa sino puede estar relativamente bien definido por las características ópticas de la formación de la imagen en el sistema de la proyección de imagen del microscopio. Si uno considera una pequeña fuente de luz fluorescente (esencialmente un punto brillante), la luz que viene de este punto separa hacia fuera el más futuro desenfocado uno está. Bajo condiciones del ideal esto produce una clase de " hourglass" forma de esta fuente de punto en la tercera dimensión (axial). Esta forma se llama la función de extensión del punto (PSF) del sistema de la proyección de imagen del microscopio. Puesto que cualquier imagen de la fluorescencia se compone de una gran cantidad de tales pequeñas fuentes de luz fluorescentes la imagen reputa el " convolved por el function" de la extensión del punto;.
Sabiendo medios de esta del punto función de extensión, eso es posible invertir este proceso hasta cierto punto por los métodos computarizados conocidos comúnmente como microscopia de la deconvolución . Hay varios algoritmos disponibles para los 2.os o la deconvolución 3D. Pueden ser clasificados áspero en el los métodos restaurativos no restaurativos de y del . Mientras que los métodos no restaurativos pueden mejorar contraste mediante la eliminación de luz del foco de los planos focales, sólo los métodos restaurativos pueden reasignarle realmente la luz lugar del origen apropiado. Esto puede ser una ventaja sobre otros tipos de la microscopia 3D tales como microscopia confocal, porque la luz no se lanza lejos sino se reutiliza. Para 3D la deconvolución uno proporciona típicamente una serie de imágenes derivadas de diversos planos focales (llamados Z-apilar) más el conocimiento del PSF que se puede derivar experimental o teóricamente de saber todos los parámetros que contribuyen del microscopio.
La cañería ascendente a NSOM es el número limitado de fotones que usted puede forzar hacia fuera una extremidad minúscula, y la eficacia minúscula de la colección (si usted está intentando recoger fluorescencia en el cercano-campo). Otras técnicas tales como ANSOM (véase abajo) intentan evitar esta desventaja.
Los nanoantennas de Bowtie se han utilizado a grandemente y reproductivo realzan el campo eléctrico en el boquete del nanómetro entre las extremidades dos triángulos del oro. Una vez más el punto es realzar una región muy pequeña de un punto diffraction-limited, así mejorando la unión mal hecha entre la luz y el nanoscale objeto-y rompiendo la barrera de la difracción.
Esta técnica también requiere una exploración de trama como NSOM y la microscopia de exploración confocal del laser estándar .
El problema grave con estas técnicas es ése para conseguir estos cuadros hermosos, él adquiere la orden de horas para recoger los datos. Ésta no es ciertamente la técnica para estudiar dinámica (caber el PSF es mejor para ése).
El SI realza la resolución espacial recogiendo la información de espacio de la frecuencia fuera de la región observable. Este proceso se hace en espacio recíproco: el Fourier transforma (pie) de una imagen del SI contiene la información adicional sobrepuesta de diversas áreas del espacio recíproco; con varios marcos con la iluminación cambió de puesto por una cierta fase, es posible separar y reconstruir de cómputo la imagen del pie, que tiene mucho más información de la resolución. El pie reverso vuelve la imagen reconstruida a una imagen de la estupendo-resolución.
Pero esto realza solamente la resolución por un factor de 2 (porque el patrón del SI no se puede enfocar cualquier cosa más pequeño que mitad de la longitud de onda de la luz de la excitación). A aumento posterior la resolución, usted puede introducir las ausencias de linealidad del, que aparecen como armónicos higher-order en el pie. Tal dispositivo podría proporcionar la resolución en la escala del nanómetro y ser absolutamente no destructivo, pero no es tan desarrollado pozo como el microscopio óptico o microscopio electrónico .
La microscopia ultrasónica de la fuerza permite el trazado local de la elasticidad en microscopia atómica de la fuerza por el uso de la vibración ultrasónica al voladizo o a la muestra. En un intento por analizar los resultados de la microscopia ultrasónica de la fuerza en una manera cuantitativa, una medida de la curva de la fuerza-distancia se hace con la vibración ultrasónica aplicada a la base voladiza, y los resultados se comparan con un modelo de la interacción voladiza de la dinámica y de la inclinar-muestra basada en la técnica de la diferencia finita.
Versiones del IR de la microscopia de la secundario-difracción (véase arriba) existir también. Éstos incluyen IR NSOM y microspectroscopy fototérmico.
Mientras que la microscopia es una herramienta central en la documentación de especímenes biológicos, es raramente suficiente justificar el descubrimiento de una nueva especie basada en investigaciones microscópicas solamente. Las pruebas a menudo genéticas y bioquímicas son necesarias confirmar el descubrimiento de una nueva especie. Un laboratorio totalmente equipado puede ser necesario, algo a menudo no disponible para los aficionados. Por esta razón puede ser inverosímil que los microscopistas aficionados son capaces de verificar su hallazgo al grado para rendir una publicación científica.
En la última 1800's microscopia aficionada se convirtió en una manía popular en los Estados Unidos y la Europa. El Juan Phin del profesor publicó el " Indirectas prácticas en la selección y el uso del microscopio (segunda edición, 1878), " y estaba también el redactor del “diario americano de la microscopia.”
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